Кристаллические структуры раскрывают каталитические и регуляторные механизмы двойного действия.

Nature Communications, том 13, номер статьи: 4880 (2022 г.) Цитировать эту статью

2545 Доступов

Подробности о метриках

Фермент E1 Uba6 инициирует передачу сигнала путем активации убиквитина и убиквитиноподобного белка FAT10 в двухэтапном процессе, включающем последовательный катализ аденилирования и образования тиоэфирной связи. Чтобы получить представление о механизме этих процессов, мы определили кристаллическую структуру комплекса Uba6/убиквитин человека. Наблюдаются две различные архитектуры комплекса: одна, в которой Uba6 принимает открытую конформацию с активным центром, настроенным для катализа аденилирования, и вторая радикально отличающаяся закрытая конформация, в которой активный центр аденилирования разбирается и реконфигурируется для катализа образования тиоэфирной связи. . Удивительно, но молекула инозитолгексакисфосфата (InsP6) связывается с ранее неидентифицированным аллостерическим сайтом на Uba6. Наши структурные, биохимические и биофизические данные показывают, что InsP6 аллостерически ингибирует активность Uba6, изменяя взаимное преобразование открытой и закрытой конформаций Uba6, а также повышая его стабильность. Помимо выявления молекулярных механизмов катализа Uba6 и аллостерической регуляции его активности, наши структуры обеспечивают основу для разработки специфичных для Uba6 ингибиторов и открывают возможность аллостерической регуляции других E1 с помощью встречающихся в природе клеточных метаболитов.

Посттрансляционная модификация (ПТМ) белков убиквитином (Ub) и убиквитиновыми белками (Ubls) лежит в основе регуляции фундаментальных клеточных процессов, включая контроль клеточного цикла, репарацию ДНК, передачу сигнала и иммунитет1. Конъюгация Ub/Ubl требует последовательного взаимодействия и активности параллельных каскадов ферментов, включающих E1, E2 и чаще всего E3, которые вместе активируют, перемещают и лигируют Ub/Ubl с белками-мишенями2. Два человеческих Ub E1, Uba1 и Uba6, действуют как привратники каскада Ub-конъюгации путем сочетания гидролиза АТФ (аденилирование) с образованием высокоэнергетической тиоэфирной связи E1-Ub (тиолирование). Затем следует перенос активированного Ub в различные репертуары родственных ферментов E2 (транстиоэтерификация)3,4,5,6,7,8,9. В то время как Uba1 специфичен для активации Ub, Uba6 проявляет двойную специфичность в отношении Ub и FAT10 5,8, причем последний представляет собой Ubl, участвующий в митотической прогрессии10, иммунитете11,12,13,14 и участвующий в развитии рака15,16,17,18,19 ,20,21.

Хотя структурная характеристика Uba6 на сегодняшний день не изучена, многочисленные исследования показали, что Uba1 представляет собой крупный многодоменный фермент, в котором каждый домен играет определенную функциональную роль во время катализа аденилирования Ub22,23, образования тиоэфирной связи E1~Ub24,25,26, и транстиоэтерификация E1-E2-Ub27,28,29,30. Активные и неактивные домены аденилирования (AAD и IAD соответственно) ответственны за первоначальное рекрутирование Ub, а также содержат каталитический механизм аденилирования C-конца Ub на первом этапе активации Ub. Домен E1 Cys организован в виде двух глобулярных полудоменов, называемых первым и вторым каталитическими полудоменами цистеина (FCCH и SCCH соответственно). Домен FCCH играет роль в распознавании Ub, а домен SCCH содержит каталитический остаток цистеина, участвующий в образовании тиоэфирной связи Ub во время второй стадии активации Ub. Недавние исследования показали, что E1 претерпевают большие конформационные изменения, необходимые для аденилирования и образования тиоэфирных связей24,25,31,32. Исследования Uba125, а также E1 для Ubl SUMO показали, что аденилирование происходит с E1 в «открытой» конформации и что образование тиоэфирной связи включает поворот примерно на 130° (или «закрытие») домена SCCH, который переносит каталитический цистеин в активный центр31. Наконец, убиквитин-фолд-домен (UFD) участвует в молекулярном распознавании E2 и последующем переносе Ub от каталитического цистеина E1 к E226,27,28,29,30. На основании анализа последовательностей5 предполагается, что Uba6 имеет такую ​​же организацию домена, что и Uba1. Однако из-за отсутствия структурных данных молекулярные механизмы, с помощью которых Uba6 активирует Ub и FAT10, неизвестны. Более того, хотя почти весь Uba1 в пролиферирующих клетках млекопитающих находится в активированном состоянии Uba1~Ub, Uba6 активируется только на 50% в аналогичных условиях6,33. Молекулярную основу этого различия еще предстоит определить.