Кристаллическая структура высококонсервативного элемента репликации РНК энтеровирусного 5' клеверного листа

Nature Communications, том 14, номер статьи: 1955 (2023) Цитировать эту статью

2622 Доступа

17 Альтметрика

Подробности о метриках

Крайний 5'-конец генома РНК энтеровируса содержит консервативный домен, подобный клеверному листу, который рекрутирует белки 3CD и PCBP, необходимые для инициации репликации генома. Здесь мы сообщаем о кристаллической структуре с разрешением 1,9 Å этого домена из генома CVB3 в комплексе с шапероном антитела. РНК сворачивается в антипараллельное четырехстороннее соединение H-типа, состоящее из четырех субдоменов с коаксиально уложенными спиралями sA-sD и sB-sC. Дальнодействующие взаимодействия между консервативным A40 в sc-петле и спиралью Py-Py внутри субдомена sD организуют почти параллельную ориентацию спиралей SA-SB и SC-SD. Наши исследования ЯМР подтверждают, что эти дальнодействующие взаимодействия происходят в растворе и без шаперона. Филогенетический анализ показывает, что наша кристаллическая структура представляет собой консервативную архитектуру энтеровирусных доменов, подобных клеверному листу, включая взаимодействия A40 и Py-Py. Исследования связывания белков также показывают, что H-образная архитектура обеспечивает готовую платформу для рекрутирования 3CD и PCBP2 для репликации вируса.

Род энтеровирусов семейства Picornaviridae включает многочисленные патогенные вирусы, вызывающие многие заболевания человека, такие как простуда, полиомиелит, острый вялый паралич и миокардит1,2,3. Эти вирусы содержат геном (+)-смысловой одноцепочечной РНК длиной около 7500 нуклеотидов (нт), который полиаденилирован на 3'-конце и ковалентно связан с вирусным белком VPg на 5'-конце (рис. 1а)4. ,5,6,7. Весь геном состоит из одной открытой рамки считывания (ORF), окруженной высококонсервативными 5'- и 3'-нетранслируемыми областями (UTR). 5'-UTR длиной около 750 нт содержит модульные домены РНК, необходимые для трансляции и репликации вирусного генома в клетках-хозяевах (дополнительный рисунок 1). Приблизительно 660 нуклеотидов 5'-UTR от положения 90 до 750, расположенных непосредственно перед ORF, вносят вклад во внутренний сайт входа рибосомы (IRES), который способствует трансляции вирусного генома посредством кэп-независимого механизма8,9,10,11. Остальные 90 нт на крайнем 5'-конце энтеровирусного генома необходимы для репликации, и было предложено принять вторичную структуру РНК, подобную клеверному листу (5'CL), которая служит платформой для интеграции необходимых вирусных и клеточных белковых факторов. для инициации репликации вирусного генома8,12,13,14,15. Здесь мы сообщаем о кристаллической структуре с высоким разрешением интактной РНК энтеровирусного клеверного листа представителя вида энтеровируса B – вируса Коксаки B3 (CVB3).

Схема генома энтеровируса, показывающая расположение 5'CL и его предполагаемую вторичную структуру с предполагаемыми сайтами связывания вирусного 3CD и белков PCBP хозяина. b Вторичная структура кристаллизационной конструкции CVB3 5'CL2a, основанная на предыдущем биохимическом анализе, где мотив связывающего эпитопа Fab BL3-6 5'-GAAACAC-3' заменяет петлю L2 субдомена sB. Нуклеотиды, окрашенные в серый цвет, представляют собой мутации или вставки по сравнению с последовательностью дикого типа. в Кристаллическая структура CVB3 5’CL2a сокристаллизована с Fab BL3-6 и решена с разрешением 1,9 Å. Fab для ясности скрыт на повернутых изображениях структуры РНК. Панели рисунков и соответствующие метки окрашены аналогично для удобства сравнения.

5'CL высококонсервативен среди всех представителей рода энтеровирусов. Было показано, что из-за такой высокой консервативности структурных особенностей энтеровирусных 5'CL химерные энтеровирусные геномы с замененными 5'CL генерируют жизнеспособные вирусные частицы16,17,18. Предполагаемая вторичная структура РНК состоит из четырех высокоорганизованных субдоменов, обозначенных sA, sB, sC и sD (рис. 1а). Субдомен sA образует базовый стебель клеверного листа, тогда как каждый из субдоменов sB, sC и sD складывается в отдельную структуру стебля-петли. Субдомен sD рекрутирует слитый вирусный белок 3CD – предшественник вирусной протеазы 3C и вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) D – посредством специфических взаимодействий петли sD с протеазой 3C17,19,20,21. Субдомен sB с последовательностью, богатой C, в петле рекрутирует поли(C)-связывающий белок хозяина (PCBP) для облегчения циркуляризации вирусного генома посредством взаимодействия с поли(A)-связывающим белком (PABP), находящимся в комплексе с 3 ′-концевой поли(А) хвост19,22,23,24,25,26,27,28,29. Домен РНК «стебель-петля», cre, в кодирующей области 2C вирусного генома также взаимодействует с 3CD30,31,32, способствуя уридилированию вирусного белка VPg31,33, который впоследствии служит праймером для (-) Синтез двухцепочечной РНК с помощью RdRp D30,34. Кроме того, было показано, что последовательность и структурная целостность 5'CL влияют на уридилирование VPg и стабильность генома, подчеркивая множественную важную роль структурных особенностей РНК в энтеровирусных 5'CL14,35. Несмотря на сильное давление отбора, высокая консервативность 5'CL в геномах энтеровирусов также подчеркивает потребность вирусов в сохранении первичных, вторичных и третичных структур РНК 5'CL для взаимодействия с белками вирусного происхождения и белками хозяина во время вирусного генома. репликация. Однако нам не хватает трехмерных структур интактного энтеровирусного 5'CL с высоким разрешением, что ограничивает наше понимание этого фундаментального вирусологического процесса, который имеет огромный потенциал для разработки таргетной терапии против энтеровирусных инфекций.